Церковь была построена в 1519 году на месте древнего храма XII века. Фрагменты его фундамента были найдены во время раскопок в 1960-х годах. Храм XII века с 1317 года был кафедральным собором Литовско-Новогрудской митрополии, при котором действовал мужской монастырь. В 1451 году храм посетил святитель Иона, митрополит Московский и всея Руси.
В 1517 году на месте древнего храма начались работы по возведению кирпичной церкви на средства крупного магната - гетмана Константина Острожского и митрополита Иосифа Солтана.
Борисоглебская церковь в 1620 году перешла к униатам. Через несколько лет митрополит Иосиф Руцкий основал при храме мужской и женский базилианские монастыри. В период с 1624 по 1632 году церковь была перестроена в стиле сарматского барокко на средства местного магната Александра Хрептовича. На фасаде появились башни с бойницами и винтовыми лестницами внутри, и храм приобрел воинственный вид.
В 1839 году церковь перешла к православным. В конце XIX века храм был снова реконструирован. Здание приобрело черты русского архитектурного стиля.
В середине XX века церковь была закрыта, а в здании разместился филиал государственного архива Гродненской области. Лишь в 1996 году храм был возвращен Православной церкви.
Борисоглебская церковь – яркий образец православной готики Великого Княжества Литовского XVI века. Первоначально он представлял собой трёхнефный четырёхстолпный храм с широкой пятигранной апсидой. Башни на фасаде были добавлены позже во время ренессансной перестройке. В архитектурном плане церковь очень напоминает ранние католические храмы княжества, но в исполнении готических элементов и оформлении фасада чувствуется мощное влияние православно-византийской традиции.
