После подписания Брестской унии в 1596 году собор перешёл к униатам. После пожара и частичного разрушения 1607 года храм находился в запустении, в 1618 году униатский архиепископ Иосафат Кунцевич восстановил и значительно перестроил собор. В 1642 году собор вновь пострадал от пожара, но был вскоре восстановлен. 11 июля 1705 года, во время Северной войны, собор был закрыт российской армией. В притворе храма разместили пороховой склад, который 1 мая 1710 года взорвался, после чего храм пролежал в руинах до 1738 года.
Восстановление собора осуществил архиепископ Флориан Гребницкий. К 1750 году на месте Софийского собора архитектором Яном Глаубицем была возведена двухбашенная базилика в стиле виленского барокко, которую освятили в честь Сошествия Святого Духа. В интерьере появились барочные колоны, много лепных украшений, фигурные карнизы. Алтарная часть храма была отделена от центрального нефа высокой трёхъярусной преградой, к которой на своде примыкало барельефное изображение Троицы Новозаветной. Второй и первый ярусы были расписаны и украшены деревянной скульптурой. От росписей на алтарной преграде сохранились: копия известной фрески Леонардо да Винчи «Тайная вечеря» и Спас Нерукотворный.
Во время Отечественной войны 1812 года храм был осквернён французскими войсками, которые использовали его как конюшню. В 1839 году собор был возвращён православным. В 1911—1914 годы был проведён капитальный ремонт собора. В 1924 году церковь закрыли и разместили в ней краеведческий музей. В период немецкой оккупации с 1942 по июль 1944 года Софийский собор был действующим, а потом был вновь закрыт.
Сегодня собор входит в состав Полоцкого историко-культурного музея-заповедника. Рядом с собором установлен один из Борисовых камней. В концертном зале храма ежегодно в апреле и ноябре проходят фестивали старинной и современной камерной и органной музыки, каждое воскресенье — концерты органной музыки в исполнении солистки концертного зала.
